在講解精準(zhǔn)定量的計算之前，我們需要了解一下分光光度法的原理，由于Oligo中的堿基之間存在共軛雙鍵，共軛雙鍵對光具有強(qiáng)吸收的特點，因此當(dāng)測量吸收光譜時，在波長260 nm或接近260 nm處都有一個吸光度（Absorbance, A260），如下圖所示：
但是，我們在引物管上通常見到的是OD值，什么是OD???？
OD???是指在260 nm波長處的光密度（Optical Density, OD），OD260測量單位定義為使用1cm的光程（pathlength）、測量260 nm波長處、1 ml寡核苷酸溶液產(chǎn)生讀數(shù)為1.0時所需要的寡核苷酸濃度。OD???值與A???值相關(guān)，計算公式為：
OD??? = A??? x 體積(ml) /光程(cm)
由于OD260測量時體積為1 ml，光程為1 cm，所以OD???值= A???值。
1. 常見定量誤區(qū)
DNA定量和RNA定量一般稱為核酸定量，通常測量樣品中DNA或RNA的平均濃度，然后再進(jìn)行下游實驗。通常，在260 nm處的吸光度即可用于測量溶液中存在的核酸的濃度。近似的轉(zhuǎn)換系數(shù)為:
a. 雙鏈DNA（ds DNA）約為50 μg/OD260；
b. 單鏈DNA（ss DNA）約為33 μg/OD260；
c. 單鏈RNA約為40 μg/OD260
當(dāng)OD=1時，依據(jù)：
摩爾數(shù)(μmol)=質(zhì)量/分子量=（轉(zhuǎn)換系數(shù)x OD）/分子量（MW）
代入濃度計算公式：
摩爾濃度(μmol/L,μM) =（摩爾數(shù)/體積）x 1000
*分子量（MW）的計算方式見文章最后部分
值得注意的是，轉(zhuǎn)換系數(shù)計算公式只適用于長的、堿基隨機(jī)排列的序列，對于長度較短的序列，重復(fù)序列，以及帶有特殊修飾基團(tuán)的Oligo序列，每個堿基的組成、排列順序和修飾都會影響序列計算，導(dǎo)致定量準(zhǔn)確率較低。
2. 什么是Oligo精準(zhǔn)定量？
對于Oligo的定量，為了保證得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，通常不能直接使用儀器測定的ng/μl數(shù)值，尤其對于帶有修飾的Oligo探針, 直接使用儀器測定的ng/μl數(shù)值會使定量結(jié)果出現(xiàn)很大的偏差。這時就需要引入對于寡核苷酸的定量計算至關(guān)重要的數(shù)值：消光系數(shù)（Extinction coefficient，ε）。
消光系數(shù)和最大吸收波長都會隨著共軛雙鍵數(shù)量的增加而增加，每個堿基的吸光度不同，堿基的組成和排列順序都會影響吸光度，因此在定量過程中引入了消光系數(shù)進(jìn)行計算。消光系數(shù)依賴于精確的核苷酸組成和排列順序，對于每個寡核苷酸來說消光系數(shù)是唯一的，因此，通過計算每個寡核苷酸的消光系數(shù)精確值，可以獲得最高的定量準(zhǔn)確度。
3. 如何計算Oligo的消光系數(shù)（ε）？
百力格使用鄰近法（Nearest neighbor method）計算每個合成的寡核苷酸的消光系數(shù)，然后用來計算每個寡核苷酸的產(chǎn)量。計算公式為：
計算.png)
其中：ε260：寡核苷酸序列在 260 nm 處的消光系數(shù)，單位為（L/mol·cm）；
Σ1N-1εNearest Neighbor：相鄰堿基對的消光系數(shù)之和；
Σ2N-1εIndividual Bases：單個堿基的消光系數(shù)之和；
Σ1NεModifications：修飾的消光系數(shù)之和。
參考鄰近值：
5'/3' position | Adenine | Guanine | Cytosine | Thymine | Uracil |
Adenine | 27,400 | 25,000 | 21,200 | 22,800 | 24,600 |
Guanine | 25,200 | 21,600 | 17,600 | 20,000 | 20,000 |
Cytosine | 21,200 | 18,000 | 14,600 | 15,200 | 17,200 |
Thymine | 23,400 | 19,000 | 16,200 | 16,800 | N/A |
Uracil | 24,000 | 21,200 | 16,200 | N/A | 19,600 |
單個堿基值：
Adenine | Guanine | Cytosine | Thymine | Uracil |
15,400 | 11,500 | 7,400 | 8,700 | 9,900 |
*即使鄰近法相對準(zhǔn)確，但是其結(jié)果也可能與真值存在偏差。
4. 如何通過消光系數(shù)（ε）計算Oligo的濃度？
根據(jù)朗伯比爾定律（Beer-Lambert Law）：
A??? = ε??? × C × p （1）
推導(dǎo)出：
C = A??? /（ε??? × p） （2）
其中：c：Oligo濃度（mol/L）；A：吸光度；ε：消光系數(shù)（L/mol·cm）； p：光程（cm）
當(dāng)光程p=1 cm，進(jìn)行單位換算后，
可得百力格濃度計算公式：
C = A??? × (1/ε???) × 106= A??? × nmol/OD
其中：c：Oligo濃度（μmol/L，μM）；A：吸光度；nmol：物質(zhì)的量單位；OD：光密度
5. 如何計算Oligo的分子量（MW）？
引物合成單上出現(xiàn)的另一個重要數(shù)據(jù)是分子量，MW用來將OD260單位轉(zhuǎn)化為質(zhì)量單位，
寡核苷酸的總分子量即所有堿基的原子量之和，再根據(jù)不同類型進(jìn)行調(diào)整：
a. 無5’單磷酸鹽的DNA序列：ssDNA-61.96 Da，dsDNA-123.38 Da；
b. 含5’單磷酸鹽的DNA序列：ssDNA+17.04 Da，dsDNA+34.08 Da；
c. 含5’三磷酸鹽的RNA序列：RNA+ 159.0 Da；
單位為道爾頓（Dalton，Da），1 Da ≈ 1 g/mol
Nucleotide | ss DNA | ds DNA | RNA |
Adenine | 313.21 Da | 616.78 Da | 329.21 Da |
Guanine | 329.21 Da | 617.88 Da | 345.21 Da |
Cytosine | 289.18 Da | 617.88 Da | 305.18 Da |
Thymine | 304.20 Da | 616.78 Da | N/A |
Uracil | N/A | N/A | 306.20 Da |
舉個例子來看一下依據(jù)經(jīng)驗值的模糊濃度計算和百力格精確濃度計算之間的差別：
如ss DNA寡核苷酸序列5’-ATGGCTAC-3’
常規(guī)計算：
分子量MW=313.21x2+304.20x2+329.21x2+289.18x2-61.96=2409.64 Da≈2409.64 g/mol
摩爾濃度(μmol/L,μM)=（轉(zhuǎn)換系數(shù)/分子量（MW））×1000
摩爾濃度(μmol/L,μM)=（33/2409.64）× 1000≈13.69 μM
百力格計算：
消光系數(shù)計算ε260=77,600 L/mol·cm
C (μmol/L，μM)= A260×(1/ε260)×106=A260×nmol/OD=A260 ×106/77,600≈12.89 μM
*1 μM=1 μmol/L=1 pmol/μl
百力格Oligo合成
相較于儀器測定的ng/μl數(shù)值，百力格的濃度計算方式更為準(zhǔn)確，尤其是對于長度較短的或者帶有特殊修飾基團(tuán)的Oligo序列，更加貼近于真值。
百力格生物依托專業(yè)的技術(shù)人員、自動分裝設(shè)備和成熟的合成純化工藝，盡可能減少操作過程中的損失，確保Oligo精準(zhǔn)和系統(tǒng)性定量
*更多合成需求請聯(lián)系當(dāng)?shù)劁N售人員
參考文獻(xiàn)：
[1]https://sg.idtdna.com/pages/education/decoded/article/oligo-quantification-getting-it-right
[4]Cavaluzzi MJ, Borer PN. (2004) Revised UV extinction coefficients for nucleoside–5‘–mono?phosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Res, 32(1) e13.
[5]Cantor CR, Warshaw MM, Shipiro H. (1970) Oligonucleotide interactions. III. Circular dichroism studies of the conformation of deoxyoligonucleolides. Biopolymers, 9(9):1059?1077.
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