在分子診斷、食品檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)室中，長期PCR產(chǎn)生的氣溶膠污染，引起qPCR、PCR假陽性結(jié)果，十分令人困擾。氣溶膠核酸污染具有擴(kuò)散性、難清除、長時(shí)間懸浮特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中，可選用UNG酶來消除氣溶膠核酸污染，以獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
一、UNG酶的作用機(jī)制
UNG酶的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈，在堿性介質(zhì)以及高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，從而被消除。
圖1 熱敏UNG清除氣溶膠污染原理
UNG酶分為普通型和熱敏型UNG酶，適用于多種場(chǎng)景PCR氣溶膠污染控制。其中，熱敏型UNG更適合一步法RT-PCR和LAMP。
二、為何選擇百力格熱敏UNG？
百力格熱敏UNG (BioZues? Heat-labile UNG)，是RT-qPCR不可或缺的幫手，氣溶膠污染物清除能力強(qiáng)，防污染效果好。在室溫下即可起作用，50℃、2min即可快速失活，對(duì)Ct值影響小，不影響測(cè)試靈敏度。
1. 清除污染效果優(yōu)異
以含"U" PCR產(chǎn)物為模板，分別加入1 U不同廠商的熱敏UNG，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。
圖2 百力格 (BLG) 和廠商A/B/C熱敏UNG去污染測(cè)試
上圖結(jié)果顯示，相較于廠商A/B/C，百力格熱敏UNG的Ct值明顯靠后，即含"U" PCR產(chǎn)物清除更徹底，去污染效果更優(yōu)。
2. 對(duì)Ct值影響小
以乙流樣本為模板進(jìn)行RT-qPCR。對(duì)照組不加UNG酶，實(shí)驗(yàn)組分別加入各廠商的熱敏UNG反應(yīng)，計(jì)算ΔCt = Ct值 (加UNG) - Ct值 (不加UNG)，ΔCt值越小說明加入的UNG對(duì)Ct值影響越小。
圖3 熱敏UNG對(duì)RNA樣本檢測(cè)擴(kuò)增曲線及Ct值的影響 (擴(kuò)增曲線圖中藍(lán)色-百力格, 紅色-廠商A, 綠色-廠商B, 玫紅-廠商C)
上圖結(jié)果顯示，加入U(xiǎn)NG前后百力格ΔCt 最小，表明百力格UNG酶對(duì)Ct值影響最小。
3.熱失活徹底
將百力格和進(jìn)口廠家熱敏UNG進(jìn)行失活測(cè)試。對(duì)照組不加UNG酶，實(shí)驗(yàn)組分別加入等量的熱處理 (55°C, 5min) 和不進(jìn)行任何處理的熱敏UNG酶，相同程序反應(yīng)，計(jì)算ΔCt = Ct值 (實(shí)驗(yàn)組) - Ct值 (對(duì)照組)，ΔCt值越小，說明熱失活越徹底，對(duì)Ct值影響越小。
圖4 熱敏UNG的清除效果及對(duì)Ct值的影響
不處理組結(jié)果顯示，加熱敏UNG的反應(yīng)均沒有Ct值，說明兩種熱敏UNG均有很好的去污染效果。
從熱處理組結(jié)果可以看出，百力格ΔCt值明顯小于進(jìn)口廠家，表明百力格熱敏UNG熱失活更徹底，對(duì)Ct值影響更小。
4. 無DNA內(nèi)切酶和外切酶殘留
取5U BioZues? Heat-labile UNG與質(zhì)粒DNA 37°C孵育，跑瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA條帶變化，驗(yàn)證百力格熱敏UNG無DNA內(nèi)切酶和外切酶殘留。
圖5 DNA內(nèi)切酶 (左) 及DNA外切酶 (右) 殘留檢測(cè)
三、產(chǎn)品推薦
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