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引探/修飾

• 1.純化方式及其詳細(xì)說明

  更新時間：2023-02-28

  脫鹽(DSL) 合成完成的寡核苷酸通過高純氨氣混合水蒸汽,在高溫高壓下將連接在CPG上的引物切下來后通過普通相層析柱進(jìn)行層析除鹽。Cartrige純化 Cartrige純化是通過反相凈化介質(zhì) (Reverse Phase Cartridge) 對引物進(jìn)行純化，純化原理與反相HPLC純化一樣。與反相HPLC比較，Cartrige是一種有效并且更加經(jīng)濟(jì)的純化方式。反相凈化濾芯通常包含一種疏水基質(zhì)如 C18的硅膠，能夠很好的吸附DNA，并且可以用水輕松地將切割下來的保護(hù)基團(tuán)和短的引物片段從反相柱上洗掉。

  
  

  PAGE純化 PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對引物DNA進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于90%，對長鏈Oligo DNA (大于50 mer)的純化特別有效。

  
  

  HPLC純化 HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對引物DNA進(jìn)行純化。該方法用于分離純化或分析時能達(dá)到很高的純度和靈敏度。在引物DNA的分析和純化中，常用的是反相（reverse-phase）HPLC。reverse phase HPLC：純度大于90%； HPLC純化主要用于修飾引物的純化。該法的缺點(diǎn)是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。

• 2.核酸換算

  更新時間：2023-03-01

  1. 摩爾數(shù)與質(zhì)量 

  1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol     

  1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol     

  1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol     

  1 μg lambda phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol     

  1 μg M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0.21 pmol     

  1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol     

  1 μg pUC18/19 DNA (2,686bp) = 0.57 pmol    

  1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 μg

  1 pmol M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 4.78 μg

  1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 μg

  1 pmol pUC18/19 DNA (2,686bp) = 1.77 μg

  1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 μg

  1 pmol lambda phage DNA (48,502bp) = 32.01 μg

  1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 μg

  
  

  2.光吸收值與濃度

  1 OD260 dsDNA = 50  μg/ml

  1 OD260 ssDNA = 33  μg/ml

  1 OD260 ssRNA = 40  μg/ml

  
  

  3.分子量

  1個脫氧核糖核酸堿基的平均分子量為333 Daltons

  1個核糖核酸堿基的平均分子量為340 Daltons

  
  

  4.核酸末端濃度

  線性DNA：pmol ends = pmol DNA ′ (number of cuts ′ 2 + 2)

  環(huán)狀DNA：pmol ends = pmol DNA ′ number of cuts ′ 2

  1 μg 線性1,000bp DNA = 3.04 pmol ends     

  1 μg 線性 FX174 DNA (5,386bp) = 0.56 pmol ends

  1 μg 線性 pUC18/19 DNA (2,686bp) = 1.14 pmol ends     

  1 μg 線性 SV40 DNA (5,243bp) = 0.58 pmol ends

  1 μg 線性 pBR322 DNA (4,361bp) = 0.7 pmol ends     

  1 μg 線性 lambda phage DNA (48,502bp) = 0.06 pmol ends

  1 μg 線性 M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0.42 pmol ends

  
  

  
  

• 3.DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL測序的準(zhǔn)確程度如何？

  更新時間：2023-03-01

  DNA測序的原理是末端終止法。具體步驟如下：

  1.定量：對樣品及引物進(jìn)行定量。

  2.測序反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入已定量的模板和引物，BigDye等試劑，PCR儀上完成測序反應(yīng)。

  3.讀取數(shù)據(jù)：根據(jù)熒光的不同，讀取被測樣品的堿基序列。ABI公司目前承諾測序結(jié)果在800bp以內(nèi)準(zhǔn)確率為98.5%。

• 4.如何測定引物的OD值？

  更新時間：2023-02-28

  用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進(jìn)而可以計算出母液的OD值。舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色杯中測定的吸光度為0.25，說明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。

• 5.核苷酸的換算

  更新時間：2023-03-01

  1.分子量

  MW (Da) = 333 ′ N (number of bases)

  
  

  2.濃度

  C (mmol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 ′ N) C (ng/ml) = OD260 ′ MW / (0.01 ′ N)

  注：MW —— molecular weight；N —— number of bases；OD260 —— absorbance at 260 nm

  
  

  3.雙鏈DNA與寡核苷酸的熔點(diǎn)：

  短于20bp的雙鏈寡核苷酸：Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

  長于20bp的雙鏈寡核苷酸： Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) –(600/N) 

  注： N —— 引物的長度(以堿基數(shù)計算)；J+ —— 單價陽離子濃度

  
  

  4.DNA與表達(dá)蛋白之間分子量換算

  1 kb DNA = 333 amino acid ≈ 3.7 ′ 104 Da

  10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA     30,000 Da Protein ≈ 810 bp DNA

  50,000 Da Protein ≈ 1350 bp DNA     100,000 Da Protein ≈ 2700 bp DNA

• 6.為什么在測序報告上找不到我的引物序列？

  更新時間：2023-03-01

  1. 如果您提供的樣品是PCR產(chǎn)物，在測序報告上找不到您的引物是正常的。這是因為測序反應(yīng)是通過對被熒光標(biāo)記的ddNTP的讀取而獲得基因序列的，而測序引物由于沒有熒光標(biāo)記，因此自然在測序結(jié)果中就不會被識別。有兩種方法可以得到您的引物序列。對于較短的PCR產(chǎn)物（<800bp），可以用另一端的引物進(jìn)行測序，從另一端測序可以一直測到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互補(bǔ)序列。對于較長的序列，一個測序反應(yīng)測不到頭，因此就只能將您的PCR產(chǎn)物片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，用載體上的通用引物進(jìn)行測序。由于載體上的通用引物與您的插入序列之間還有一段距離，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在測序的起始端總會有一些堿基無法準(zhǔn)確讀出，因此，您如果想得到您的PCR產(chǎn)物的完整序列，最好克隆后進(jìn)行測序。

  2. 如果您提供的樣品是質(zhì)粒或菌液，PCR產(chǎn)物用載體克隆后，由于克隆的方向是隨機(jī)的，因此，當(dāng)您在一條鏈上找不到您的引物序列時,請嘗試在互補(bǔ)鏈上尋找您的引物序列。

  3. 當(dāng)測序引物離您的插入片段很近時，有時可能也無法找到您的引物的全序列。這主要是因為有時測序的起始端由于未去除的染料或引物二聚體的干擾，造成起始區(qū)的序列不好，可能無法找到您的引物完整序列。

   4. 有時，質(zhì)粒做模板進(jìn)行測序時，由于某些原因，質(zhì)粒上沒有插入外援片段，為空載體，所測的序列完全為載體序列，此時自然也找不到引物序列。

• 7.我的引物做PCR效果很好，為什么用于測序總得不到好的結(jié)果？

  更新時間：2023-03-01

  用于測序的引物比用作PCR反應(yīng)的引物要求高，以下是不適合用于測序反應(yīng)的引物類型：

  
  

  1.不純的引物：用于測序的引物純度要求很高，合成中的小片段會直接造成嚴(yán)重的背景峰，因此用于測序的引物序列長度一般在24個堿基之內(nèi)，因為過長的引物純度不易保證。

  2.簡并引物、隨機(jī)引物和有特殊標(biāo)記的引物。

• 8.怎樣溶解引物？

  更新時間：2023-02-28

  我們的的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘 的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。

• 9.合成的引物應(yīng)如何保存?

  更新時間：2023-02-28

  沒有溶解的引物/探針可以在-20℃下保存至少24個月，溶解好的引物/探針可以事先稀釋為 100uM 的儲存液，分裝數(shù)份保存于-20℃冰箱，可以保存至少18個月以上(反復(fù)多次凍融會降低使用壽命)。使用前，將濃溶液稀釋成工作液(10pmol/ul或20pmol/ul)后進(jìn)行實驗。

  
  

• 10.如何檢測引物的純度？

  更新時間：2023-02-28

  實驗室方便的做法是使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（<12個堿基的引物用20%的膠，12-60個堿基的引物用16%的膠，>60個堿基的引物用12%的膠）取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95℃，2mins）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時間后（約2-3小時）剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的（有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，這是引物二級結(jié)構(gòu)條帶）。

• 11.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基團(tuán)嗎?

  更新時間：2023-02-28

  沒有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加磷酸基團(tuán)，訂貨時請?zhí)貏e注明，此時需收取磷酸化的費(fèi)用。

• 12.密碼子優(yōu)化有必要嗎？

  更新時間：2023-03-01

  有必要。不同來源的種屬密碼子的偏好性不同。比如，在人體內(nèi)受偏愛的密碼子對于E. coli來說可能是稀有的。百力格公司已經(jīng)為國內(nèi)外客戶優(yōu)化了大量的基因，有自主研發(fā)的專業(yè)軟件?？擅赓M(fèi)為客戶提供密碼子優(yōu)化服務(wù)。

• 13.合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時無目的帶，怎么辦?

  更新時間：2023-02-28

  PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。

  1) 引物和模板是否配對，同源性有多大?

  2) 引物本身是否有立體結(jié)構(gòu).

  3) PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作?

  4) PCR儀是否工作正常?5) PCR反應(yīng)條件是否合適?

  如果一切正常，還無法解決問題時，我們可以免費(fèi)重新合成引物。

• 14.定了引物的OD值后發(fā)現(xiàn)A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?

  更新時間：2023-02-28

  由于核酸在260nm附近有強(qiáng)吸收，而蛋白質(zhì)在280nm附近有強(qiáng)吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時，常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的引物的A260/A280比值也不同， 例如當(dāng)序列中C、T堿基的含量高時，該比值會大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度.

• 15.百力格公司的標(biāo)準(zhǔn)免費(fèi)克隆載體是什么？

  更新時間：2023-03-01

  (1) pUC系列（pUC18/pUC19/pUC57），pBuescript II SK(+l)，PCR2.1等載體：含有若干常用限制性內(nèi)切酶識別序列；

  (2) pTG19-T 載體：適用于T/A克?。涣硗?，本公司還有近300種商業(yè)表達(dá)載體（如pET系列，pPIC系列）可供基因合成后克隆選擇；

  若有特殊要求，需換到一些特殊載體或改造過的載體，為方便后續(xù)實驗的及時進(jìn)行，請?zhí)峁┹d體及相關(guān)的載體信息。

• 16.用退火緩沖液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反應(yīng)？

  更新時間：2023-02-28

  一般來講，20個堿基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應(yīng)。 EDTA)溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數(shù)混合，總體積不要超過500微升，加熱到95℃ 2mins，然后緩慢冷卻至室溫(低于30度)即可。退火的產(chǎn)物可以放在4度待用。

• 17.使用3%的Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發(fā)現(xiàn)有很多條泳帶，為什么?

  更新時間：2023-02-28

  對引物進(jìn)行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時，容易出現(xiàn)多條泳帶，更無法用Agarose電泳進(jìn)行定量了。

• 18.能否根據(jù)引物電泳后EB染色后條帶的亮度對合成的引物進(jìn)行定量?

  更新時間：2023-02-28

  不能。因為EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu)，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據(jù)EB染色帶的亮度來對合成的DNA進(jìn)行定量。

• 19.2OD的引物可以多少做次PCR反應(yīng)？

  更新時間：2023-03-01

  一般來講，20個堿基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應(yīng)。

• 20.引物在常溫下運(yùn)輸，會降解嗎？

  更新時間：2023-03-01

  不會降解，干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上。而一般的運(yùn)輸時間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會降解。

• 21.合成的熒光標(biāo)記探針應(yīng)如何保存?

  更新時間：2023-03-01

  1) 熒光探針必須避光保存。

  2)干品請于-20℃保存。

  3) 強(qiáng)烈建議用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩(wěn)定，保存時間更長。通常，將探針配制成100 pmol/ul的儲備液，分裝成幾份 (避免反復(fù)凍融)，于-20℃保存。使用前，將配制好的儲備液稀釋成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul)，剩余部分于-20℃保存。

• 22.電泳時，長度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?

  更新時間：2023-03-01

  1) A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；

  2) DNA的立體結(jié)構(gòu)不同，電泳速度不同。 這種情況在Oligo DNA越短時越容易發(fā)生，長鏈Oligo DNA之間差別較小。

• 23.收到的基因為什么質(zhì)粒切不動，或切不全?

  更新時間：2023-03-01

  可能原因如下：

  (1)質(zhì)粒上酶識別序列不正確或者沒有；

  (2)酶切反應(yīng)條件不合適

  (3)限制性內(nèi)切酶對DNA甲基化敏感；

  (4)內(nèi)切酶稀釋不正確或加入方法不正確；

  (5)甘油濃度過高；

  (6) 限制性內(nèi)切酶已部分或全部失活；

  (7)保護(hù)堿基引入導(dǎo)致側(cè)翼鏈鎖死酶切位點(diǎn)。

  
  

  對策：

  (1)檢查質(zhì)粒DNA中是否存在可被限制酶識別的DNA序列。

  (2)優(yōu)化酶反應(yīng)體系，使用隨酶提供的反應(yīng)緩沖液；增大酶量或更換新酶。

  (3)檢查DNA是否已被甲基化，所用的酶是否對甲基化敏感。

  (4) 更換保護(hù)堿基，或PCR擴(kuò)增目的片段，酶切PCR產(chǎn)物。

• 24.PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯誤，怎么辦?

  更新時間：2023-03-01

  1) 因為引物純度不可能是100%，因此，挑選克隆時，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時，請重新挑選一個克隆測序，會得到正確的結(jié)果。

  2) 如果挑選2 ~ 3個克隆測序情況還沒改觀，我們會免費(fèi)重新合成引物。

• 25.進(jìn)行蛋白表達(dá)實驗數(shù)個月不成功，后經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)引物處有錯誤，怎么辦?

  更新時間：2023-03-01

  1) 表達(dá)實驗之前一定要對DNA序列進(jìn)行驗證。

  2) 我們可以免費(fèi)重新合成引物。

  3) 如進(jìn)行索賠時，按國際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價格范圍之內(nèi)。

• 26.如何運(yùn)輸以及保存質(zhì)粒及其菌株？

  更新時間：2023-03-01

  我們?yōu)槟峁┖型耆_的基因序列的質(zhì)粒（不少于5ug）兩管。質(zhì)粒可常溫運(yùn)輸，溶解后需－20℃保存，并盡量避免反復(fù)凍融。

• 27.客戶提供樣品做相關(guān)服務(wù)時，送樣要求有哪些？

  更新時間：2023-03-01

  質(zhì)粒樣品，可以是穿刺菌、甘油菌、凍干質(zhì)粒或質(zhì)粒溶液等形式。

  
  

  1)穿刺菌：請?zhí)峁┐┐膛囵B(yǎng)的單克隆菌落。穿刺培養(yǎng)的菌可以長時間保存而不會導(dǎo)致質(zhì)粒的拷貝數(shù)明顯下降。樣品請在1.5ml或2ml的Eppendorf管中加入相應(yīng)抗生素的固體LB培養(yǎng)基，然后將單菌落用牙簽穿刺于LB固體培養(yǎng)基中。

  2)菌液：請將過夜培養(yǎng)的菌液加滅菌甘油至終濃度20%保存于1.5ml或2ml的Eppendorf管中，注意封口，以免污染。

  3)質(zhì)粒：請?zhí)峁?-5ug溶于無菌去離子水的質(zhì)粒溶液或者抽干質(zhì)粒。

  4)注意：

   a. 請將裝有樣品的Eppendorf 管口用封口膜封緊，防止運(yùn)輸途中開蓋導(dǎo)致樣品污染或者丟失。

   b. 請在管壁上注明質(zhì)粒名稱及抗性。

   c. 載體其他信息請以郵件或便簽等形式告知。

• 28.平端的PCR產(chǎn)物難以克隆，為什么?

  更新時間：2023-03-01

  由于一般的PCR用引物的5′末端都沒有磷酸基團(tuán)，因此，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物的5′末端也沒有磷酸基團(tuán)。當(dāng)克隆于去磷酸化的末端平滑載體時，無法克隆進(jìn)去；而當(dāng)克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時，背景會極高。此時請對PCR產(chǎn)物的5′端進(jìn)行磷酸 (PO4修飾) 化處理。

• 29.進(jìn)行反義核酸實驗時，是否要對DNA鏈全部進(jìn)行S代修飾，除了S代外，還有什么辦法可增加核酸在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性?

  更新時間：2023-03-01

  DNA經(jīng)S代修飾后比較穩(wěn)定，在細(xì)胞中不會被核酸酶降解。如果整條鏈全部S代，的確能增加DNA的穩(wěn)定性，但會降低其Tm值，也即降低該反義DNA與靶序列的結(jié)合效率。因此，科研人員一般采用將DNA片段兩端插入數(shù)個(通常3個)S代磷酯鍵Phosphorothioated Bonds)，這樣既能增加DNA的穩(wěn)定性，又能增加反義DNA與靶序列的結(jié)合能力。不過如果要將反義DNA注入到活的動物體內(nèi)，為增強(qiáng)穩(wěn)定性，還是將整條鏈S代效果更好。

• 30.FITC、6-FAM、5-FAM標(biāo)記之間有何區(qū)別?

  更新時間：2023-03-01

  它們皆是熒光素標(biāo)記 (Fluorescein)，5-FAM與6-FAM互為異構(gòu)體；而FITC則在與Oligo的連接方式上(硫脲鍵) 有別于前者(酰胺鍵)，但它們的發(fā)色團(tuán)均為熒光素，通常使用中沒有區(qū)別。

• 31.淬滅基團(tuán)為TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的雙標(biāo)記熒光探針在使用上有什么不同?

  更新時間：2023-03-01

  由淬滅基團(tuán)TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標(biāo)記熒光探針常常被用作水解探針(Hydrolysis Probes)，或稱"TaqMan"探針，用于Real Time PCR實驗。由于這些淬滅染料的光譜學(xué)性質(zhì)不同(見下圖)，作為淬滅基團(tuán)使用時的特點(diǎn)也不同，現(xiàn)說明如下：

  1) TAMRA為熒光染料，在淬滅報告基團(tuán)的同時，自身會在更高波長處發(fā)射熒光，此發(fā)射熒光會對報告基團(tuán)的檢測造成影響，探針熒光本底 (Background)相對較高。而Eclipse及BHQ系列為非熒光染料，淬滅報告基團(tuán)，但自身不發(fā)射熒光，因此，探針熒光本底低，信噪比更大，檢測靈敏度更高。

  2) 淬滅基團(tuán)對報告基團(tuán)的淬滅有賴于二者的光譜迭蓋(Overlapping),也即報告基團(tuán)的熒光光譜應(yīng)與淬滅基團(tuán)的吸收光譜相交搭。對比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光譜，可見TAMRA的吸收光譜覆蓋范圍窄，可與之匹配的報告基團(tuán)種類比較少；而Eclipse則具有更寬的吸收范圍(390 nm-625 nm)，可淬滅的報告基團(tuán)種類很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋范圍則更廣，從430 nm一直到近紅外，可淬滅的報告基團(tuán)種類更多 (象Cy3、Cy5等的淬滅效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料組成一套雙標(biāo)記熒光探針用于多重PCR(Multiplexing PCR)。

• 32.TaqMan 探針設(shè)計時應(yīng)遵循哪些原則?

  更新時間：2023-03-01

  1) 探針應(yīng)位于兩引物之間；

  2) 探針中堿基G、C的含量應(yīng)在20%～80%之間；

  3) 避免同種堿基成串出現(xiàn)，特別是堿基“G”；

  4) 堿基G不要出現(xiàn)在5’末端；

  5) 探針的Tm值要比引物的Tm值高8～10℃，應(yīng)在68～70℃之間；

  6) 探針長度超過30個堿基時，最好把淬滅基團(tuán)放在中間，以防止熒光本底過高，這時探針的3’末端應(yīng)加磷酸基封阻，以防探針在PCR反應(yīng)過程中延伸。

• 33.何謂分子信標(biāo) (Molecular Probes)？與普通的雙標(biāo)記探針 (如TaqMan探針)相比，在使用上有什么特殊性？

  更新時間：2023-03-01

  Molecular Probes是一類特殊的雙標(biāo)記探針，通常狀態(tài)下，其兩末端互補(bǔ)配對，形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu) (發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu))，發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)迫使分別連在兩末端的報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊密鄰近 (此時檢測不到熒光)，而一旦雜交到靶序列上，則報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，Molecular Probes變得明亮起來，可檢測到熒光。由于發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，探針對靶序列檢測的特異性增強(qiáng)，相對于普通的雙標(biāo)記探針 (如TaqMan探針)，Molecular Probes對SNP有更強(qiáng)的識別能力，能區(qū)分序列上僅相差一個堿基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP檢測。此外，Molecular Probes也應(yīng)用于活體細(xì)胞內(nèi)的mRNA雜交、RNA加工、及轉(zhuǎn)錄過程的時時監(jiān)測研究等。 

• 34.UHP-siRNA化學(xué)修飾即用型套餐（1/3或2/5）特點(diǎn)優(yōu)勢？

  更新時間：2025-10-24

  UHP-siRNA化學(xué)修飾即用型套餐應(yīng)用場景：針對目標(biāo)靶基因設(shè)計篩選有效siRNA靶點(diǎn)，為小核酸藥物開發(fā)或基因功能研究提供有效工具原料。

  
  

  產(chǎn)品優(yōu)勢：

  1. 提高siRNA其特異性、穩(wěn)定性、降低其免疫原性；可發(fā)掘出功效性更好的干擾靶點(diǎn)；

  2. 該產(chǎn)品套餐含對照，轉(zhuǎn)染試劑，使用便捷，比單獨(dú)購買相關(guān)組分成本節(jié)約30%以上

• 35.擴(kuò)增曲線的熒光信號值低的原因是什么?

  更新時間：2025-10-31

  擴(kuò)增曲線存在問題時，首先應(yīng)確認(rèn)基線校正或ROX校正前的原始曲線，擴(kuò)增曲線的熒光信號值低多數(shù)是由于背景熒光信號值過高造成的。 

  使用SYBR Green染料法進(jìn)行檢測時，背景熒光信號偏高大多數(shù)是由于模板量過高，染料嵌入到初始模板DNA中發(fā)出熒光造成的。

  使用探針法進(jìn)行檢測時，背景熒光信號偏高大多是由于設(shè)計的探針參數(shù)評分不高，使淬滅基團(tuán)的淬滅作用不充分、報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的搭配不合理等；探針的熒光標(biāo)記效率低或出現(xiàn)降解等也是影響之一。

  
  

• 36.siRNA/miRNA mimics/inhibitor/ASO 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低

  更新時間：2025-10-24

  需要考慮如下幾個原因：

   1） siRNA 等 RNA oligo 純度太低；

   2） RNA 酶污染，建議使用經(jīng) DEPC 處理過的或無 RNA 酶的耗材和試劑；   3） 轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量不高或形成復(fù)合物的過程操作不當(dāng)； 

   4） 有些轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率易受血清影響，配制混合物時，不能含有血清； 

   5） 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑保存不當(dāng)；

   6） 觀察熒光淬滅或熒光設(shè)備有問題，如觀察熒光波段不當(dāng)或觀察時間太久，建議 4-6 小時及時換液觀察。

• 37.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象

  更新時間：2025-10-24

  1） 細(xì)胞狀態(tài)欠佳，或可能有污染物如支原體， 建議更換細(xì)胞或調(diào)整細(xì)胞生長狀態(tài)， 一般處于良好生長狀態(tài)的細(xì)胞對轉(zhuǎn)染試劑有更好的耐受性

  2） siRNA 等 oligo 或者轉(zhuǎn)染試劑濃度過高或轉(zhuǎn)染試劑毒性較大， 需更換轉(zhuǎn)染試劑

  
  

• 38.目的基因干擾效果判斷標(biāo)準(zhǔn)

  更新時間：2025-10-24

  1）對于非套餐產(chǎn)品，我們不能保證干擾效果，但是可以通過質(zhì)譜鑒定保證序列合成準(zhǔn)確性；

  2） 對于套餐產(chǎn)品，轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到 80%以上，我們保證套餐中至少 1 個干擾靶點(diǎn)， mRNA 干擾效果能達(dá)到 70%左右。 個別情況干擾效果若＜70%， 但是統(tǒng)計學(xué)差異可以達(dá)到顯著性差異的（p<0.05）， 其干擾效果也是有意義的；

  3） 如果細(xì)胞的蛋白或其他表型及功能有顯著變化，一般可通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化實驗體系，檢測不同時間點(diǎn)等方法來獲取最佳干擾效果。

  
  

• 39.RNAi 實驗為何以 mRNA 水平檢測為主？檢測蛋白和其他功能為輔？

  更新時間：2025-10-24

  由于 siRNA/miRNA mimics/inhibitor/ASO 直接作用于 RNA，所以首先需要檢測 mRNA 變化水平。通常 mRNA 下調(diào)會導(dǎo)致其編碼蛋白下調(diào)， 但是如果出現(xiàn) mRNA 下降水平與蛋白下降水平不一致的情況， 其可能原因有：

  1） 與選擇的檢測時間有關(guān)?？赡?mRNA 下調(diào)后，目的蛋白還未達(dá)到明顯變化水平，多數(shù)都會出現(xiàn)滯后現(xiàn)象， 但是個別也有提前變化。建議檢測時間

  點(diǎn)至少有 2 個以上，以便選擇明顯變化的時間點(diǎn)；

  2）蛋白變化水平可能維持在一個固定區(qū)間，不會隨 RNA 變化出現(xiàn)明顯改變；

  3）個別抗體存在特異性問題，抗體經(jīng)過敲除實驗驗證可抗性可信度較高；

  4）細(xì)胞功能判斷干擾效果的影響因素較為復(fù)雜，個別基因變化不一定引起細(xì)胞功能表型明顯變化，并且細(xì)胞的代償機(jī)制會起到協(xié)同互補(bǔ)作用；

  5） miRNA 大多作用于基因 3’ -UTR 區(qū)域，可能會阻止蛋白翻譯， 但是不一定會降解 mRNA。

  
  

• 40.超級淬滅探針比常規(guī)BHQ探針有哪些優(yōu)勢？

  更新時間：2025-10-31

  信噪比提升、Ct值減少 、高GC序列良好適用性 、更低本底，更高相對熒光強(qiáng)度

• 41.MGB探針相比常規(guī)BHQ探針有哪些特點(diǎn)？

  更新時間：2025-10-31

  可提高TM值約15°C，適用于AT 富集序列，可設(shè)計較短序列，與序列的結(jié)合能力更強(qiáng)

• 42.rAPP腺苷化修飾的用途是什么？

  更新時間：2025-10-31

  小RNA（small RNA）文庫構(gòu)建過程中，避免RNA分子的自連，減少文庫中RNA嵌合體的存在。

• 43.訂購表中檢驗報告中H+M+F+C分別代表什么含義？

  更新時間：2025-10-31

  H代表HPLC報告，M代表MASS報告，F(xiàn)代表全波長掃描報告，C代表濃度報告

• 44.如何確認(rèn)模板中是否含有抑制物質(zhì)?

  更新時間：2025-10-31

  使用較高濃度的模板按3～4個梯度稀釋，并使用其進(jìn)行Real Time RT-PCR反應(yīng)或Real Time PCR反應(yīng)。如果無抑制物質(zhì)存在，得到的Ct值會依存模板濃度的變化而變化；如果有抑制物質(zhì)存在，就會發(fā)現(xiàn)高濃度的模板有反應(yīng)性能下降的現(xiàn)象。 抑制物的影響或可通過稀釋樣本消除

• 45.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？

  更新時間：2025-10-31

  通常可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA)，因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。

• 46.全長接頭與截短型接頭的區(qū)別是什么？

  更新時間：2025-10-31

  全長接頭：1）包含測序時所需要的全部序列，可不進(jìn)行PCR反應(yīng)而直接上機(jī)測序。2）可用于構(gòu)建PCR-Free的文庫，PCR-free文庫可以降低PCR擴(kuò)增偏好性、錯誤率以及序列重復(fù)。

  截短型接頭：1）需要通過PCR擴(kuò)增形式形成完整接頭才能上機(jī)測序。2）連接效率，建庫產(chǎn)量高于全長接頭。3）接頭二聚體片段較小，可以通過磁珠純化進(jìn)行有效的去除。

  
  

• 47.UMI接頭的作用？

  更新時間：2025-10-31

  可實現(xiàn)雙端UMI校正，提高低頻突變檢測的靈敏度和特異性。

• 48.qPCR擴(kuò)增效率低

  更新時間：2025-10-31

  1)反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 

  2)反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。 

  3)反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。 

  4)引物設(shè)計的評分不高，容易形成二級結(jié)構(gòu)或是不易退火，重新設(shè)計新的引物進(jìn)行實驗。 

  5)試劑未充分混勻或移液誤差，建議重復(fù)實驗。

  6)qPCR試劑的影響：試劑中DNA聚合酶濃度較低或Buffer中離子濃度非最優(yōu)化，導(dǎo)致Taq酶活力未達(dá)最強(qiáng)。

  
  

• 49.qPCR擴(kuò)增效率較高？例如>110%

  更新時間：2025-10-31

  1）非特異性擴(kuò)增，建議降低引物濃度，改變退火溫度或重新設(shè)計引物

  2）引物二聚體，建議降低引物濃度或重新設(shè)計引物

  3）模板稀釋錯誤，建議重新制備梯度稀釋樣本

  
  

• 50.Ct值過大的原因

  更新時間：2025-10-31

  可能為模板濃度太低、體系有抑制和擴(kuò)增效率低，建議適當(dāng)提高模板濃度，優(yōu)化反應(yīng)條件（見擴(kuò)增效率低），或嘗試更換試劑。

• 51.Ct值過小的原因

  更新時間：2025-10-31

  可能為模板濃度過高，體系內(nèi)有污染，引物形成二聚體。建議適當(dāng)增加稀釋比例，更換所有試劑杜絕污染，重新設(shè)計不容易形成二聚體或非特性擴(kuò)增的引物序列。

• 52.ASO 和 miRNA 的儲存是否與 siRNA 相同

  更新時間：2025-10-24

  1. ASO：凍干粉需 -20°C 保存，溶解后建議分裝存于 -80°C。ASO 對核酸酶敏感，溶解需用無核酸酶水或DEPC水。

  2. miRNA（如agomir/antagomir）：與 siRNA 類似，但需注意化學(xué)修飾（如 2′-O-甲基修飾）穩(wěn)定性更高，可室溫保存數(shù)周，但長期仍需 -80°C保存；天然 miRNA 易降解，溶解后立即使用或 -80°C 分裝。

• 53.NGS接頭，由百力格進(jìn)行退火時，退火效率大概是多少，退火交付的溶度是多少？退火后需要稀釋的話，可以提供稀釋的buffer嗎？

  更新時間：2025-10-24

  退火效率沒有量化數(shù)值，可以做瓊脂糖凝膠檢測，短接頭接近100%退火。 交付濃度可以定制，我們成品是15uM?？梢蕴峁┫♂層玫耐嘶餬uffer。

• 54.百力格的成品接頭5ul一個反應(yīng)，如果是低投入量建庫，例如1ng，也是加5ul嗎？

  更新時間：2025-10-24

  1. 50ng投入量以上，直接加5ul一個反應(yīng)

  2. 低于50ng建庫，接頭要做相應(yīng)的稀釋。1ng的投入量，建庫接頭需要稀釋5-15倍再加入5ul

  
  

• 55.接頭質(zhì)檢全檢還是抽檢？

  更新時間：2025-10-24

  合成的index 引物每條都有MS和HPLC質(zhì)檢，接頭退火會做退火效率檢查

• 56.百力格成品接頭的污染率是多少？拆分率是多少？

  更新時間：2025-10-24

  污染率萬分之一以下；拆分率97.9%（10nt，允許1錯配）

• 57.酶切建庫試劑盒有沒有單獨(dú)的酶切步驟的模塊？

  更新時間：2025-10-24

  沒有單獨(dú)的酶切步驟的模塊，酶切和修復(fù)一體進(jìn)行

• 58.使用酶切建庫試劑盒做gDNA，F(xiàn)FPE樣本建庫，有推薦的酶切時間嗎？

  更新時間：2025-10-24

  gDNA切10min；FFPE DNA切2-8min，降解程度越高，酶切時間越短。重度降解都是小片段的樣本建議不用酶切打斷，直接用百力格通用建庫試劑盒修復(fù)建庫

• 59.酶切試建庫劑盒會引入假陽性嗎？可否耐受樣本中含te？

  更新時間：2025-10-24

  1. 理論上酶切和機(jī)械打斷建庫都會引起嵌合體，可能會導(dǎo)致假陽性。百力格酶切建庫試劑盒通過優(yōu)化buffer和酶體系，有著極低的嵌合體率。且嵌合體可以通過下游的生信分析流程進(jìn)行過濾。

  2. 耐受樣本中含te。

  
  

• 60.接頭序列中 硫代修飾的作用是什么？

  更新時間：2025-10-24

  硫代修飾是為了防降解、阻止核酸酶消化，一般在最后一個堿基加一個硫代。

  
  

• 61.溶解 siRNA 應(yīng)該用什么溶劑？儲存條件如何？

  更新時間：2025-10-24

  1. 溶劑要求：必須使用無核酸酶水或DEPC水溶解凍干粉，避免使用普通蒸餾水，否則會導(dǎo)致降解。

  2. 未溶解凍干粉：-20°C 或 -80°C保存，室溫運(yùn)輸后需離心使粉末沉底。

  3. 溶解后短期分裝保存于 -20°C（非自動除霜冰箱）。長期：-80°C 保存，避免反復(fù)凍融。

• 62.siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞鋪板密度為什么重要？

  更新時間：2025-10-24

  成功轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞會產(chǎn)生目標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)，但未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞卻不受影響，這時轉(zhuǎn)染效率和總的細(xì)胞數(shù)量就很重要，一般細(xì)胞數(shù)量較少時轉(zhuǎn)染效率高，一些試劑由于本身毒性的影響，太低的細(xì)胞數(shù)量時毒性明顯，所以會要求較高的細(xì)胞密度；所以根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑毒性以及經(jīng)驗選擇合適的細(xì)胞密度是試驗成功的關(guān)鍵。

• 63.siRNA 轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞方面如何優(yōu)化？?

  更新時間：2025-10-24

  細(xì)胞狀態(tài)：細(xì)胞密度需 60–80% 匯合度，過高（>90%）或狀態(tài)差顯著降低效率。

• 64.如何減少 siRNA 的脫靶效應(yīng)（Off-target Effects）？

  更新時間：2025-10-24

  使用化學(xué)修飾 siRNA（如 2′-O-甲基、LNA 修飾）減少與非靶標(biāo) mRNA 結(jié)合；選擇多靶點(diǎn) siRNA 庫（Pooled siRNA）或驗證至少 2 條獨(dú)立序列。免疫原性控制：避免含“GUCCUUCAA”等免疫刺激序列，采用硫代磷酸酯（PS）骨架修飾。

• 65.ASO 細(xì)胞攝取效率低怎么辦？?

  更新時間：2025-10-24

  化學(xué)修飾：硫代磷酸酯（PS）修飾增強(qiáng)親脂性，提高被動擴(kuò)散效率。靶向遞送：偶聯(lián)配體（如 GalNAc 肝靶向、葉酸受體靶向）提升細(xì)胞特異性攝取。

• 66.細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是否與 siRNA/miRNA mimics/inhibitor/ASO 等序列相關(guān)？

  更新時間：2025-10-24

  通常由于 siRNA 等小核酸 oligo 序列大小非常接近，轉(zhuǎn)染效率高低與 siRNA 的序列并沒有直接關(guān)系， 但是有些修飾如膽固醇可以提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率高低的關(guān)鍵取決于細(xì)胞本身及轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染方法等。

• 67.小核酸藥物引發(fā)免疫反應(yīng)如何規(guī)避？?

  更新時間：2025-10-24

  1. 修飾核苷酸：2′-O-甲基、2′-氟代修飾避免 TLR 識別。

  2. 遞送系統(tǒng)優(yōu)化：LNP 表面 PEG 化減少非特異性免疫細(xì)胞吸附。

• 68.相同的 siRNA/miRNA mimics/inhibitor/ASO，在不同細(xì)胞中是否有同樣的干擾效果

  更新時間：2025-10-24

  由于不同細(xì)胞的基因表達(dá)水平、 轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞狀態(tài)等都可能存在差異， 導(dǎo)致 siRNA 等靶點(diǎn)的干擾效率存在差異，所以不同細(xì)胞的干擾效果不能保證一致， 但是只要有一株細(xì)胞檢測確認(rèn)干擾效果， 則可以證明設(shè)計合成的 siRNA 有效。

• 69.做RNAi相關(guān)實驗，轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞提RNA做RT-PCR,但一個都沒有起到干擾效果，陽性對照是干擾的GAPDH也沒有出現(xiàn)干擾效果，請問怎么辦?

  更新時間：2025-10-24

  如果轉(zhuǎn)染效率沒有問題，陽性對照為陰性，說明：

  1.轉(zhuǎn)染實驗和操作沒有問題。

  2.RT-PCR與WB有結(jié)果，RT-PCR如果沒有被污染，應(yīng)該過程沒有問題。

  說明更多的問題出現(xiàn)在siRNA本身上。

  
  

• 70.動物實驗中轉(zhuǎn)染試劑和核酸用量？

  更新時間：2025-10-24

  轉(zhuǎn)染RNA和DNA的劑量有差別，一般來說，RNA尾靜脈注射成年小鼠，每只每次需要100ug核酸和50ul轉(zhuǎn)染試劑。局部注射的劑量會小很多，大約總注射量的1/8為轉(zhuǎn)染試劑。